重组人溶菌酶的研究进展
庞恋苏 李亚男
【摘要】 人溶菌酶是一种人体内天然存在的具有抗菌、抗病毒、抗炎、增强免疫力等特性的蛋白质。它直接作用于细菌细胞壁，因此，细菌对其完全不存在耐药性，也无免疫原性。利用基因工程生产出的重组人溶菌酶不仅具有人溶菌酶的优点，同时也克服了人溶菌酶活性低、产量低、不便于制备、无法稳定保存等缺点。在抗菌药物滥用、耐药菌株广泛存在的今天，由于其特性可以弥补众多抗生素的不足，具有广泛的临床应用前景。本文就针对重组人溶菌酶的研究进展做一综述。
关键词：溶菌酶；重组人溶菌酶；药理作用；生物功能
[中国图书分类号] R780. 1 [文献标识码] A [文章编号] 1672- 2973(2017)05- 0306- 04
Research progress of recombinant human lysozyme
PANG Lian-su, LI Ya-nan (Department of stomatology, Chinese PLA General Hospital and Chinese PLA Medical school, Beijing 100853, China)
[ Abstract] Recombinant Human lysozyme is a kind of protein that has antibacterial, anti-viral, anti - inflammatory and immunological properties. Recombinant human lysozyme is a natural antibacterial agent, directly acting on bacterial cell wall. It has no drug resistance in bacteria and immunogenicity. Recombinant human lysozyme not only has the advantage of human lysozyme but also has better antibacterial activity, more production, easy to prepare and stable preservation. It has very promising clinical application prospectespecially bacterial resistant strains are widespread. The research progress of recombinant human lysozyme is reviewed.
Key words: Lysozyme; Recombinant human lysozyme; Pharmacological; Biological functions
* 基金项目：企事业单位合作课题(项目编号: HXKTLIYANAN001)
庞恋苏 解放军医学院 硕士生 北京 100853
李亚男 通讯作者 解放军总医院口腔修复科副主任医师 副教授 北京 100853
溶菌酶起源于 1922 年 Fleming 在人的鼻粘液中发现一种能够溶解细菌细胞壁的物质，并将其命名为“Lysozyme”，即溶解细菌的蛋白质。溶菌酶全称 1, 4- β- N 乙酰胞壁酸聚糖水解酶，又称为细胞壁溶解酶，在高等动物的体液中分布广泛，它具有抗菌、抗病毒、消炎、增强免疫力等特性[1]。随 着日益出现的耐药型细菌以及人体对抗生素类药物的严重不良反应，急需要一种新型的无耐药性、无抗原性、无毒性的抗菌药物，基因工程技术的发展使得重组人溶菌酶得以生产，人们期待将重组人溶菌酶用于临床。
1. 人溶菌酶的分子结构和理化生物特性
人溶菌酶是由 130 个氨基酸组成的单肽链蛋白质，是一种阳离子碱性蛋白质，呈白色结晶状或无定形粉末固相，常温即可溶于水，化学性质稳定， 最适宜温度是 25℃，在高温和酸溶液环境中活性也保持稳定，碱溶液中不稳定，天然人溶菌酶主要存在于人体体液、组织内外细胞液和人体器官中， 作为一种重要的非特异性体液免疫因子，若缺乏可导致严重的免疫系统疾病。溶菌酶在人体唾液中以游离和复合物这两型存在：
(1)游离型主要是呈团簇状的阳离子蛋白质；
(2)复合物型与阴离子蛋白质、多糖、大分子物质共同组成[2]。细菌细胞壁溶菌酶根据靶向作用的位点不同，可以细分为作用于β- 1, 4 糖苷键和作用于肽“尾”这两种类型，溶解真菌的主要是依赖裂解酵母菌细胞壁和霉菌细胞壁的溶菌酶。
溶菌酶溶菌作用机制是借助于几种酶或非酶物质共同作用溶解细菌细胞壁达到杀菌效果，哺乳动物体内细胞无细胞壁，不存在肽聚糖，溶菌酶无靶向位点，故对人体细胞不会产生破坏作用。因为革兰氏阴性细菌只有内层壁为肽聚糖，而革兰氏阳性细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，所以人溶菌酶抗革兰氏阳性菌效应高于革兰氏阴性菌[3]。真菌细胞壁中的连接键几丁质也是人溶菌酶的底物，人溶菌酶可以使其 β- 1, 4 糖苷键断裂而使细胞壁溶解，并且 PH= 5 是溶解几丁质最好的条件，因此溶菌酶可以溶解真菌细胞壁而治疗其引起的感染[4]。人溶菌酶蛋白质抗病毒机制是双方所带的异种电荷能够紧密结合在一起，与病毒 DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，破坏病毒内部结构达到使病毒失活的作用[5]。溶菌酶还有改善和增强巨噬细胞细胞免疫的作用，使白细胞增多、减轻内毒素的作用，使机体受损可以通过加快自身免疫反应并释放炎症因子[6]。同时，人溶菌酶能够激活血小板、发挥并加强人体第二道防线功能，从而实现抗菌、消炎、止疼等作用。人体中溶菌酶的分布和含量体现了某些疾病的发生、发展，可作为疾病诊断的重要指标。
2. 重组人溶菌酶药效学研究
吕秋军[7]学者发现重组人溶菌酶具有较强的抗菌性能。对革兰氏阳性菌如金葡球菌、表皮葡萄糖球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌活性强，尤其对耐药菌有效，与其他抗生素联用后， 体外抑菌活性明显增强，还具有抗炎、镇痛作用， 在急性、长期毒性试验中，wistar 大鼠、猕猴均未发现毒性靶器官，为后期制备抗耐药菌新药提供参考。多项研究实验证明，对重组人溶菌酶和溶菌酶标准品抑菌活性的比较试验中，重组人溶菌酶对致病菌与益生菌的抑菌性能均明显强于溶菌酶标准品，它表现出更优异的低剂量即达到标准溶菌酶的抗菌活性[5]。已有研究证明溶菌酶可以抗冠状疱疹病毒、腺病毒生长，也可用于带状疱疹、腮腺炎、鸡水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治疗[8]，也有研究资料提示，人溶菌酶是抗HIV 感染、抗SARS 的辅助治疗药物[9]。
Tenovuo 等[10]临床研究显示，将口腔牙膏与溶菌酶混合可更有效的预防龋齿，效果优于直接添加抗菌剂。变形链球菌是目前公认的可疑致病菌[11]， 溶菌酶能够破坏变形链球菌的细胞壁完整性达到抗龋的效果。牙周炎[12]主要认为是细菌的菌群紊乱导致，优势菌群的存在，破坏牙周膜细胞从而发病，
而重组人溶菌酶通过抑制优势菌可以改善疾病。牙齿釉质表面覆盖的一层薄膜中含有溶菌酶，它可以隔离外界环境对牙釉质的酸蚀破坏，提示可以通过制备溶菌酶制剂达到护齿的目的。Samaranayake 等[13]体外模型研究发现，少量的溶菌酶即可抑制念珠菌生物膜的形成。重组人溶菌酶和抗真菌剂同时使用还具有协同作用，能够有效抑制真菌感染。
3. 重组人溶菌酶制备与临床转化应用研究
人溶菌酶存在提取困难和活性难以保证等问题，现国内生产的溶菌酶制剂主要是从鸡蛋的蛋壳和蛋清中提取得来的，可以进行规模化生产，并已经进入临床应用。国外则以动物和霉菌为原料进行生产，在大肠杆菌、酵母菌以及动物、植物中都有表达重组人溶菌酶的相关研究。1986 年Murakami[14] 在啤酒酵母中表达出的重组人溶菌酶因为包涵体形式存在而不具有活性，后又在大肠杆菌上表达生产人溶菌酶，但都存在产量小，活性低的问题。1988 年 Yoshimura 等[15, 16]学者通过接上一段鸡溶菌酶信号肽，从而使啤酒酵母分泌了有活性的人溶菌酶。2001 年贾向志等[17]在巴斯得毕赤酵母上得到重组人溶菌酶的表达，但低等宿主中表达的重组人溶菌酶时常会以不溶的包涵体形式存在而无活性， 表达产量也无法达到要求。经过近 20 年的研究， 采用单分子克隆技术构建重组表达质粒，筛选出能够高表达的人溶菌酶的工程菌，发现巴斯得毕赤酵母菌具有高效表达、稳定遗传的特点，打破了低等生物表达产物活性低的瓶颈。结合巴斯得毕赤酵母营养要求低、可高密度发酵、稳定遗传性强等优点，重组人溶菌酶可以在临床上广泛应用。可研究逐渐发现，从各种微生物原材料中提取人溶菌酶仍存在一些固有缺陷：(1)生物原材料无法保证每一物种都能够高产量、稳定表达；(2)物种来源也容易受到污染，是否在传代的过程中不产生物种隔离； (3)生物活性不容易稳定遗传，持续性无法得到保证。经过几十年的研究，现利用 DNA 重组技术动物反应器表达获得产物就可以克服这些问题，通过转基因技术表达重组人溶菌酶与天然人溶菌酶理化性质、生物活性总体上无差别。
2006 年 Murray [18]小组已经成功在山羊乳腺中得到表达并稳定遗传，国内李宁院士[19]的团队2011 年在奶牛乳腺上得到表达，并获得高产和稳定遗传。动物乳腺生物反应器生产的重组人溶菌酶与天然人体产生的溶菌酶并无显著差别[20]。奶牛生物反应器可以高表达出重组人溶菌酶，也可以减少奶牛乳腺炎的发病率，奶液更加健康，其体内常见益生菌也未受到抑制。重组人溶菌酶还可以提高仔猪抗腹泻的能力[21, 22]。
由于重组人溶菌酶的广谱抗菌特性，又安全无毒副作用，已用在食品加工、副食品产品制作中， 医疗卫生也已经有各种溶菌酶药物剂型，主要应用于上呼吸道感染、口腔等疾病。人溶菌酶作为一种非特异性免疫蛋白，它能够在自身免疫中发挥及其重要的作用，是人类机体免疫的第一道防线。对口腔内牙周炎、龋齿、复发性阿弗他溃疡、扁平苔藓、智齿冠周炎、天疱疮的治疗均有一定作用[23]。我国复旦大学学者[24]进行了多中心、随机、双盲、 多剂量平行对照评价重组人溶菌酶喷雾剂治疗咽炎、扁桃体炎的疗效及安全性的研究，现提示疗效及安全性均较好，但缺乏长期的临床试验观察及数据分析，临床上应用仍需要进一步数据支持。
3. 重组人溶菌酶研发的优势与存在的问题
综上，重组人溶菌酶是一种广谱抗菌、抗病毒药物，能够有效杀死毒性微生物并保护自身不受损害，同时与其他药物相互作用无交叉反应。具有上述优点，使得重组人溶菌酶可以在畜牧业、食品产业、临床治疗中得到发展。因为它的应用十分广泛，也引起了世界卫生组织、粮食农业组织的重视，现已经用来抗仔猪腹泻病、抗山羊、奶牛乳腺炎，也可以做食品的防腐剂，已用在青稞、肉制品、以及牛奶的保质防腐等用途上。现在已经进行药用生产的主要是鸡蛋蛋清溶菌酶，而它仅是重组人溶菌酶活性的 1/ 3，同时由于异源性对人体有免疫排斥反应，也无法对抗机体内的细菌、病毒等。人溶菌酶热稳定性也要远高于鸡蛋清溶菌酶，蛋清溶菌酶较于人溶菌酶抗菌谱较窄，而且人溶菌酶还有多种自身独有的药理作用，如抗炎、抗病毒、增强免疫力及抗肿瘤等。
目前用于商品化的人溶菌酶多从人乳汁和胎盘中提取，存在着来源受限、产量极低、质量不稳定、含有未知病原、价格高昂等问题，不能满足于市场需求。对于重组人溶菌酶的大规模化生产与临床应用仍存在三个主要问题。第一，由于重组人溶菌酶在转基因动物乳腺中表达稳定性差、异位表达、整合率低以及生长周期漫长、风险高、资金回报率不可预测、环境安全对于是否发生水平基因漂移等问题亟待解决。第二，对于特定疾病、细菌、耐药菌、真菌、病毒的临床实验室研究还是少数。第三，转基因生物安全性还需要进一步研究，有待于更进一步的完善。第四，利用动物反应器生产出来的产品是否会对当地环境造成污染，周边生态是否会产生破坏。第五，动物福利问题。转基因动物产物临床制品的开放是一个长期的过程， 中间需要大量实验室研究、中间试验、环境释放、生产性试验、安全评估、生物安全福利、伦理学审查、安全证书、临床前研究、临床前动物试验、临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期试验，需要逐步积累经验、收集数据，均要进行风险评估和安全评价，确保生物安全性。
4. 重组人溶菌酶未来展望
由于重组人溶菌酶具有安全、无毒、抗菌谱广、无残留、生物相容性好等特点，具有极其广阔的应用前景，预测今后的重组人溶菌酶会在以下几个方面开展：(1)人溶菌酶基因水平上进行结构改造、研究，利用微生物作载体开发具有实际意义的工程菌，以制取出更大产量、性质更加稳定、能够持续遗传的产品；(2)进行动物生物反应器的制造， 并能够得到目的、安全的表达，解决动物福利问题，隔绝基因污染；(3)应用于临床、食品及工业用途；(4)技术上攻克研发瓶颈，降低研究成本。在如今耐药性细菌泛滥的时期，能够早日开发重组人溶菌酶产品，为今后的控制感染、抑制有害细菌、毒素带来裨益，会是未来的研究方向和趋势， 相信今后的人溶菌酶一定会得到广泛的应用。
参 考 文 献
[1] Eichenberger A P, Gat tin Z, Yalak G, et al. Molecular Dy- namics Simulation of Ester- Linked Hen Egg White Lysozyme Reveals the Effect of Missing Backbone Hydrogen Bond Donors on the Protein Structure[J]. Helvetica Chimica Acta, 2010, 93 (10): 1857- 1869
[2] Wu H, Cao D, Liu T, et al. Purification and Characterization of Recombinant Huma n Lysozyme from Eggs of TransgenicChickens[J]. Plos One, 2015, 10(12): e0146032
[3] Oliver W T, Wells J E. Lysozyme as an alternative to growth promoting antibiotics in swine production[J]. Journal of Ani- mal Science and Biotechnology, 2015, 6(1): 35
[4] Xin- Xin L I, Tao J J, Long Y U. Recombinant Human Lysozyme LYZL4: Expression in Pichia pastoris and Its An- tibacterial Activity[J]. China Biotechnology, 2014
[5] Li J, Helmerhorst E J, Troxler R F, et al. Identification of in vivo pellicle constituents by analysis of serum immune re- sponses[J]. Journal of Dental Research, 2004, 83(1): 60
[6] Ruiz E D, Almada M, Burboa M G, et al. Oligomers, protofib- rils and amyloid fibrils from recombinant human lysozyme (r HL): fibrillation process and cytotoxicity evaluation for ARPE- 19 cell line [J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2014, 126: 335
[7] 吕秋军, 卞广兴. 抗感染新药重组人溶菌酶的临床前评价[J].中国新药杂志, 2006, 15(17): 1436- 1439
[8] Zhao H, Tang J, Cao L, et al. Characterization of bioactive recombinant antimicrobial peptide parasin I fused with hu- man lysozyme expressed in the yeast Pichia pastoris system [J]. Enzyme & Microbial Technology, 2015, 77(3): 61
[9] Hai W, Wu H, Wang K, et al. Expression of recombinant human lysozyme in transgenic chicken promotes the growth of Bifidobacterium, in the intestine and improves postnatal growth of chicken[J]. Amb Express, 2016, 6(1): 110
[10] Tenovuo J, Lumikari M, Soukka T. Salivary lysozyme, lacto- ferrin and peroxidases: antibacterial effects on cariogenic bacteria and clinical applications in preventive dentistry [J]. Proceedings of the Finnish Dental Society Suomen Ham- masl覿覿k覿riseuran Toimituksia, 1991, 87(2): 197
[11] 崔 伟, 王成龙. 变形链球菌蛋白质组学研究进展[J]. 中华老年口腔医学杂志, 2016, 14(6): 352- 355
[12] 刘 奕, 王 峰, 鄂玲玲, 等. 牙龈卟啉单胞菌脂多糖在高糖条件下对人脐静脉内皮细胞表达 ICAM- 1 的影响[J]. 中华老年口腔医学杂志, 2016, 14(2): 83- 86
[13] Matano M, Nakajima K, Kashiwagi Y, et al. Sweetnesscharacterization of recombinant human lysozyme [J]. Com- parative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology, 2015, 188: 8- 14
[14] Murakami. New developments in zeolite science and technol- ogy[M]. Kodansha, 1986.
[15] Yoshimura K, Toibana A, Nakahama K. Human lysozyme: sequencing of a cDNA, and expression and secretion by Sac- charomyces cerevisiae[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 1988, 150(2): 794
[16] 李新新, 陶建军, 余 龙. 人源溶菌酶基因LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定[J]. 中国生物工程杂志, 2014, 34(1):79- 85
[17] 贾向志, 马文煜. 人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[M]. 第四军医大学, 2001
[18] Maga E A, Cullor J S, Smith W, et al. Human lysozyme ex- pressed in the mammary gland of transgenic dairy goats can inhibit the growth of bacteria that cause mastitis and the cold- spoilage of milk [J]. Foodborne Pathogens & Disease, 2006, 3(4): 384
[19] Tong J, Wei H, Liu X, et al. Production of recombinant hu- man lysozyme in the milk of transgenic pigs [J]. Transgenic Research, 2011, 20(2): 417- 419
[20] 梁振鑫, 尹富强, 刘庆友, 等. 转基因动物乳腺生物反应器相关技术及研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(2): 92- 98
[21] Lu D, Liu S, Shang S, et al. High- level expression of re- combinant human lysozyme in the milk of transgenic pigs[J].Transgenic Research, 2013, 22(1): 219- 219
[22] Lu D, Liu S, Shang S, et al. Production of transgenic- cloned pigs expressing large quantities of recombinant human lysozyme in milk[J]. Plos One, 2015, 10(5): e0123551
[23] 魏 莉, 许 颖, 娄兵新. 溶菌酶对微小小单胞菌生物膜的影响[J]. 中国微生态学杂志, 2017(5)
[24] 潘 珏, 修清玉, 吴昌归，等. 多中心、随机、双盲、多剂量平行对照评价重组人溶菌酶喷雾剂治疗咽炎、扁桃体炎的疗 效及安全性[J]. 国际呼吸杂志, 2011, 31(12): 890- 895
(收稿日期：2017- 06- 10)
（声明：如有侵权，请及时联系我们进行删除）
重组人溶菌酶的研究进展
庞恋苏 李亚男
【摘要】 人溶菌酶是一种人体内天然存在的具有抗菌、抗病毒、抗炎、增强免疫力等特性的蛋白质。它直接作用于细菌细胞壁，因此，细菌对其完全不存在耐药性，也无免疫原性。利用基因工程生产出的重组人溶菌酶不仅具有人溶菌酶的优点，同时也克服了人溶菌酶活性低、产量低、不便于制备、无法稳定保存等缺点。在抗菌药物滥用、耐药菌株广泛存在的今天，由于其特性可以弥补众多抗生素的不足，具有广泛的临床应用前景。本文就针对重组人溶菌酶的研究进展做一综述。
关键词：溶菌酶；重组人溶菌酶；药理作用；生物功能
[中国图书分类号] R780. 1 [文献标识码] A [文章编号] 1672- 2973(2017)05- 0306- 04
Research progress of recombinant human lysozyme
PANG Lian-su, LI Ya-nan (Department of stomatology, Chinese PLA General Hospital and Chinese PLA Medical school, Beijing 100853, China)
[ Abstract] Recombinant Human lysozyme is a kind of protein that has antibacterial, anti-viral, anti - inflammatory and immunological properties. Recombinant human lysozyme is a natural antibacterial agent, directly acting on bacterial cell wall. It has no drug resistance in bacteria and immunogenicity. Recombinant human lysozyme not only has the advantage of human lysozyme but also has better antibacterial activity, more production, easy to prepare and stable preservation. It has very promising clinical application prospectespecially bacterial resistant strains are widespread. The research progress of recombinant human lysozyme is reviewed.
Key words: Lysozyme; Recombinant human lysozyme; Pharmacological; Biological functions
* 基金项目：企事业单位合作课题(项目编号: HXKTLIYANAN001)
庞恋苏 解放军医学院 硕士生 北京 100853
李亚男 通讯作者 解放军总医院口腔修复科副主任医师 副教授 北京 100853
溶菌酶起源于 1922 年 Fleming 在人的鼻粘液中发现一种能够溶解细菌细胞壁的物质，并将其命名为“Lysozyme”，即溶解细菌的蛋白质。溶菌酶全称 1, 4- β- N 乙酰胞壁酸聚糖水解酶，又称为细胞壁溶解酶，在高等动物的体液中分布广泛，它具有抗菌、抗病毒、消炎、增强免疫力等特性[1]。随 着日益出现的耐药型细菌以及人体对抗生素类药物的严重不良反应，急需要一种新型的无耐药性、无抗原性、无毒性的抗菌药物，基因工程技术的发展使得重组人溶菌酶得以生产，人们期待将重组人溶菌酶用于临床。
1. 人溶菌酶的分子结构和理化生物特性
人溶菌酶是由 130 个氨基酸组成的单肽链蛋白质，是一种阳离子碱性蛋白质，呈白色结晶状或无定形粉末固相，常温即可溶于水，化学性质稳定， 最适宜温度是 25℃，在高温和酸溶液环境中活性也保持稳定，碱溶液中不稳定，天然人溶菌酶主要存在于人体体液、组织内外细胞液和人体器官中， 作为一种重要的非特异性体液免疫因子，若缺乏可导致严重的免疫系统疾病。溶菌酶在人体唾液中以游离和复合物这两型存在：
(1)游离型主要是呈团簇状的阳离子蛋白质；
(2)复合物型与阴离子蛋白质、多糖、大分子物质共同组成[2]。细菌细胞壁溶菌酶根据靶向作用的位点不同，可以细分为作用于β- 1, 4 糖苷键和作用于肽“尾”这两种类型，溶解真菌的主要是依赖裂解酵母菌细胞壁和霉菌细胞壁的溶菌酶。
溶菌酶溶菌作用机制是借助于几种酶或非酶物质共同作用溶解细菌细胞壁达到杀菌效果，哺乳动物体内细胞无细胞壁，不存在肽聚糖，溶菌酶无靶向位点，故对人体细胞不会产生破坏作用。因为革兰氏阴性细菌只有内层壁为肽聚糖，而革兰氏阳性细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，所以人溶菌酶抗革兰氏阳性菌效应高于革兰氏阴性菌[3]。真菌细胞壁中的连接键几丁质也是人溶菌酶的底物，人溶菌酶可以使其 β- 1, 4 糖苷键断裂而使细胞壁溶解，并且 PH= 5 是溶解几丁质最好的条件，因此溶菌酶可以溶解真菌细胞壁而治疗其引起的感染[4]。人溶菌酶蛋白质抗病毒机制是双方所带的异种电荷能够紧密结合在一起，与病毒 DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，破坏病毒内部结构达到使病毒失活的作用[5]。溶菌酶还有改善和增强巨噬细胞细胞免疫的作用，使白细胞增多、减轻内毒素的作用，使机体受损可以通过加快自身免疫反应并释放炎症因子[6]。同时，人溶菌酶能够激活血小板、发挥并加强人体第二道防线功能，从而实现抗菌、消炎、止疼等作用。人体中溶菌酶的分布和含量体现了某些疾病的发生、发展，可作为疾病诊断的重要指标。
2. 重组人溶菌酶药效学研究
吕秋军[7]学者发现重组人溶菌酶具有较强的抗菌性能。对革兰氏阳性菌如金葡球菌、表皮葡萄糖球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌活性强，尤其对耐药菌有效，与其他抗生素联用后， 体外抑菌活性明显增强，还具有抗炎、镇痛作用， 在急性、长期毒性试验中，wistar 大鼠、猕猴均未发现毒性靶器官，为后期制备抗耐药菌新药提供参考。多项研究实验证明，对重组人溶菌酶和溶菌酶标准品抑菌活性的比较试验中，重组人溶菌酶对致病菌与益生菌的抑菌性能均明显强于溶菌酶标准品，它表现出更优异的低剂量即达到标准溶菌酶的抗菌活性[5]。已有研究证明溶菌酶可以抗冠状疱疹病毒、腺病毒生长，也可用于带状疱疹、腮腺炎、鸡水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治疗[8]，也有研究资料提示，人溶菌酶是抗HIV 感染、抗SARS 的辅助治疗药物[9]。
Tenovuo 等[10]临床研究显示，将口腔牙膏与溶菌酶混合可更有效的预防龋齿，效果优于直接添加抗菌剂。变形链球菌是目前公认的可疑致病菌[11]， 溶菌酶能够破坏变形链球菌的细胞壁完整性达到抗龋的效果。牙周炎[12]主要认为是细菌的菌群紊乱导致，优势菌群的存在，破坏牙周膜细胞从而发病，
而重组人溶菌酶通过抑制优势菌可以改善疾病。牙齿釉质表面覆盖的一层薄膜中含有溶菌酶，它可以隔离外界环境对牙釉质的酸蚀破坏，提示可以通过制备溶菌酶制剂达到护齿的目的。Samaranayake 等[13]体外模型研究发现，少量的溶菌酶即可抑制念珠菌生物膜的形成。重组人溶菌酶和抗真菌剂同时使用还具有协同作用，能够有效抑制真菌感染。
3. 重组人溶菌酶制备与临床转化应用研究
人溶菌酶存在提取困难和活性难以保证等问题，现国内生产的溶菌酶制剂主要是从鸡蛋的蛋壳和蛋清中提取得来的，可以进行规模化生产，并已经进入临床应用。国外则以动物和霉菌为原料进行生产，在大肠杆菌、酵母菌以及动物、植物中都有表达重组人溶菌酶的相关研究。1986 年Murakami[14] 在啤酒酵母中表达出的重组人溶菌酶因为包涵体形式存在而不具有活性，后又在大肠杆菌上表达生产人溶菌酶，但都存在产量小，活性低的问题。1988 年 Yoshimura 等[15, 16]学者通过接上一段鸡溶菌酶信号肽，从而使啤酒酵母分泌了有活性的人溶菌酶。2001 年贾向志等[17]在巴斯得毕赤酵母上得到重组人溶菌酶的表达，但低等宿主中表达的重组人溶菌酶时常会以不溶的包涵体形式存在而无活性， 表达产量也无法达到要求。经过近 20 年的研究， 采用单分子克隆技术构建重组表达质粒，筛选出能够高表达的人溶菌酶的工程菌，发现巴斯得毕赤酵母菌具有高效表达、稳定遗传的特点，打破了低等生物表达产物活性低的瓶颈。结合巴斯得毕赤酵母营养要求低、可高密度发酵、稳定遗传性强等优点，重组人溶菌酶可以在临床上广泛应用。可研究逐渐发现，从各种微生物原材料中提取人溶菌酶仍存在一些固有缺陷：(1)生物原材料无法保证每一物种都能够高产量、稳定表达；(2)物种来源也容易受到污染，是否在传代的过程中不产生物种隔离； (3)生物活性不容易稳定遗传，持续性无法得到保证。经过几十年的研究，现利用 DNA 重组技术动物反应器表达获得产物就可以克服这些问题，通过转基因技术表达重组人溶菌酶与天然人溶菌酶理化性质、生物活性总体上无差别。
2006 年 Murray [18]小组已经成功在山羊乳腺中得到表达并稳定遗传，国内李宁院士[19]的团队2011 年在奶牛乳腺上得到表达，并获得高产和稳定遗传。动物乳腺生物反应器生产的重组人溶菌酶与天然人体产生的溶菌酶并无显著差别[20]。奶牛生物反应器可以高表达出重组人溶菌酶，也可以减少奶牛乳腺炎的发病率，奶液更加健康，其体内常见益生菌也未受到抑制。重组人溶菌酶还可以提高仔猪抗腹泻的能力[21, 22]。
由于重组人溶菌酶的广谱抗菌特性，又安全无毒副作用，已用在食品加工、副食品产品制作中， 医疗卫生也已经有各种溶菌酶药物剂型，主要应用于上呼吸道感染、口腔等疾病。人溶菌酶作为一种非特异性免疫蛋白，它能够在自身免疫中发挥及其重要的作用，是人类机体免疫的第一道防线。对口腔内牙周炎、龋齿、复发性阿弗他溃疡、扁平苔藓、智齿冠周炎、天疱疮的治疗均有一定作用[23]。我国复旦大学学者[24]进行了多中心、随机、双盲、 多剂量平行对照评价重组人溶菌酶喷雾剂治疗咽炎、扁桃体炎的疗效及安全性的研究，现提示疗效及安全性均较好，但缺乏长期的临床试验观察及数据分析，临床上应用仍需要进一步数据支持。
3. 重组人溶菌酶研发的优势与存在的问题
综上，重组人溶菌酶是一种广谱抗菌、抗病毒药物，能够有效杀死毒性微生物并保护自身不受损害，同时与其他药物相互作用无交叉反应。具有上述优点，使得重组人溶菌酶可以在畜牧业、食品产业、临床治疗中得到发展。因为它的应用十分广泛，也引起了世界卫生组织、粮食农业组织的重视，现已经用来抗仔猪腹泻病、抗山羊、奶牛乳腺炎，也可以做食品的防腐剂，已用在青稞、肉制品、以及牛奶的保质防腐等用途上。现在已经进行药用生产的主要是鸡蛋蛋清溶菌酶，而它仅是重组人溶菌酶活性的 1/ 3，同时由于异源性对人体有免疫排斥反应，也无法对抗机体内的细菌、病毒等。人溶菌酶热稳定性也要远高于鸡蛋清溶菌酶，蛋清溶菌酶较于人溶菌酶抗菌谱较窄，而且人溶菌酶还有多种自身独有的药理作用，如抗炎、抗病毒、增强免疫力及抗肿瘤等。
目前用于商品化的人溶菌酶多从人乳汁和胎盘中提取，存在着来源受限、产量极低、质量不稳定、含有未知病原、价格高昂等问题，不能满足于市场需求。对于重组人溶菌酶的大规模化生产与临床应用仍存在三个主要问题。第一，由于重组人溶菌酶在转基因动物乳腺中表达稳定性差、异位表达、整合率低以及生长周期漫长、风险高、资金回报率不可预测、环境安全对于是否发生水平基因漂移等问题亟待解决。第二，对于特定疾病、细菌、耐药菌、真菌、病毒的临床实验室研究还是少数。第三，转基因生物安全性还需要进一步研究，有待于更进一步的完善。第四，利用动物反应器生产出来的产品是否会对当地环境造成污染，周边生态是否会产生破坏。第五，动物福利问题。转基因动物产物临床制品的开放是一个长期的过程， 中间需要大量实验室研究、中间试验、环境释放、生产性试验、安全评估、生物安全福利、伦理学审查、安全证书、临床前研究、临床前动物试验、临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期试验，需要逐步积累经验、收集数据，均要进行风险评估和安全评价，确保生物安全性。
4. 重组人溶菌酶未来展望
由于重组人溶菌酶具有安全、无毒、抗菌谱广、无残留、生物相容性好等特点，具有极其广阔的应用前景，预测今后的重组人溶菌酶会在以下几个方面开展：(1)人溶菌酶基因水平上进行结构改造、研究，利用微生物作载体开发具有实际意义的工程菌，以制取出更大产量、性质更加稳定、能够持续遗传的产品；(2)进行动物生物反应器的制造， 并能够得到目的、安全的表达，解决动物福利问题，隔绝基因污染；(3)应用于临床、食品及工业用途；(4)技术上攻克研发瓶颈，降低研究成本。在如今耐药性细菌泛滥的时期，能够早日开发重组人溶菌酶产品，为今后的控制感染、抑制有害细菌、毒素带来裨益，会是未来的研究方向和趋势， 相信今后的人溶菌酶一定会得到广泛的应用。
参 考 文 献
[1] Eichenberger A P, Gat tin Z, Yalak G, et al. Molecular Dy- namics Simulation of Ester- Linked Hen Egg White Lysozyme Reveals the Effect of Missing Backbone Hydrogen Bond Donors on the Protein Structure[J]. Helvetica Chimica Acta, 2010, 93 (10): 1857- 1869
[2] Wu H, Cao D, Liu T, et al. Purification and Characterization of Recombinant Huma n Lysozyme from Eggs of TransgenicChickens[J]. Plos One, 2015, 10(12): e0146032
[3] Oliver W T, Wells J E. Lysozyme as an alternative to growth promoting antibiotics in swine production[J]. Journal of Ani- mal Science and Biotechnology, 2015, 6(1): 35
[4] Xin- Xin L I, Tao J J, Long Y U. Recombinant Human Lysozyme LYZL4: Expression in Pichia pastoris and Its An- tibacterial Activity[J]. China Biotechnology, 2014
[5] Li J, Helmerhorst E J, Troxler R F, et al. Identification of in vivo pellicle constituents by analysis of serum immune re- sponses[J]. Journal of Dental Research, 2004, 83(1): 60
[6] Ruiz E D, Almada M, Burboa M G, et al. Oligomers, protofib- rils and amyloid fibrils from recombinant human lysozyme (r HL): fibrillation process and cytotoxicity evaluation for ARPE- 19 cell line [J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2014, 126: 335
[7] 吕秋军, 卞广兴. 抗感染新药重组人溶菌酶的临床前评价[J].中国新药杂志, 2006, 15(17): 1436- 1439
[8] Zhao H, Tang J, Cao L, et al. Characterization of bioactive recombinant antimicrobial peptide parasin I fused with hu- man lysozyme expressed in the yeast Pichia pastoris system [J]. Enzyme & Microbial Technology, 2015, 77(3): 61
[9] Hai W, Wu H, Wang K, et al. Expression of recombinant human lysozyme in transgenic chicken promotes the growth of Bifidobacterium, in the intestine and improves postnatal growth of chicken[J]. Amb Express, 2016, 6(1): 110
[10] Tenovuo J, Lumikari M, Soukka T. Salivary lysozyme, lacto- ferrin and peroxidases: antibacterial effects on cariogenic bacteria and clinical applications in preventive dentistry [J]. Proceedings of the Finnish Dental Society Suomen Ham- masl覿覿k覿riseuran Toimituksia, 1991, 87(2): 197
[11] 崔 伟, 王成龙. 变形链球菌蛋白质组学研究进展[J]. 中华老年口腔医学杂志, 2016, 14(6): 352- 355
[12] 刘 奕, 王 峰, 鄂玲玲, 等. 牙龈卟啉单胞菌脂多糖在高糖条件下对人脐静脉内皮细胞表达 ICAM- 1 的影响[J]. 中华老年口腔医学杂志, 2016, 14(2): 83- 86
[13] Matano M, Nakajima K, Kashiwagi Y, et al. Sweetnesscharacterization of recombinant human lysozyme [J]. Com- parative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology, 2015, 188: 8- 14
[14] Murakami. New developments in zeolite science and technol- ogy[M]. Kodansha, 1986.
[15] Yoshimura K, Toibana A, Nakahama K. Human lysozyme: sequencing of a cDNA, and expression and secretion by Sac- charomyces cerevisiae[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 1988, 150(2): 794
[16] 李新新, 陶建军, 余 龙. 人源溶菌酶基因LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定[J]. 中国生物工程杂志, 2014, 34(1):79- 85
[17] 贾向志, 马文煜. 人溶菌酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[M]. 第四军医大学, 2001
[18] Maga E A, Cullor J S, Smith W, et al. Human lysozyme ex- pressed in the mammary gland of transgenic dairy goats can inhibit the growth of bacteria that cause mastitis and the cold- spoilage of milk [J]. Foodborne Pathogens & Disease, 2006, 3(4): 384
[19] Tong J, Wei H, Liu X, et al. Production of recombinant hu- man lysozyme in the milk of transgenic pigs [J]. Transgenic Research, 2011, 20(2): 417- 419
[20] 梁振鑫, 尹富强, 刘庆友, 等. 转基因动物乳腺生物反应器相关技术及研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(2): 92- 98
[21] Lu D, Liu S, Shang S, et al. High- level expression of re- combinant human lysozyme in the milk of transgenic pigs[J].Transgenic Research, 2013, 22(1): 219- 219
[22] Lu D, Liu S, Shang S, et al. Production of transgenic- cloned pigs expressing large quantities of recombinant human lysozyme in milk[J]. Plos One, 2015, 10(5): e0123551
[23] 魏 莉, 许 颖, 娄兵新. 溶菌酶对微小小单胞菌生物膜的影响[J]. 中国微生态学杂志, 2017(5)
[24] 潘 珏, 修清玉, 吴昌归，等. 多中心、随机、双盲、多剂量平行对照评价重组人溶菌酶喷雾剂治疗咽炎、扁桃体炎的疗 效及安全性[J]. 国际呼吸杂志, 2011, 31(12): 890- 895
(收稿日期：2017- 06- 10)
（声明：如有侵权，请及时联系我们进行删除）
